Leishla Marie’s Bioblog

Esta es la última entrada de este semestre para el primer grupo que pasó por la fundación de Amgen BioMinds. Me llevo muchas lindas experiencias, conocimiento, práctica y un mejor desarrollo y desempeño como estudiante subgraduado. En el BioMinds Research Day pude ver los frutos de nuestra investigación, y la de mis compañeros, lo cual me hace sentir orgullosa de ellos y de mi misma.

Este dia tuvimos la tarea de visitar tres poster, previamente asignados, como extrategia de conocer los trabajos de los estudiantes de otros recintos (Ciencias Médicas, Rio Piedras, Cayey, Humacao y Mayagüez). En mi caso, evalué dos estudiantes de Humacao y una estudiante de Rio Piedras, y resumiendo, sus trabajos fueron excelentes, de mucho esfuerzo y sacrificios, y con buenos resultados.

Estos tres compañeros se demostraron tener conocimiento sobre el tema, sabían con certeza lo que decía y las contestaciones a las preguntas realizadas fueron claras y haciendo énfasis a los datos del afiche. Comenzando con Ricardo representante del afiche titulado Diversity and Spatial Distribution of Navicula sp. and Pinnularia sp. in the Pond of the Forest of the University of Puerto Rico at Humacao; ésta comenzó los estudios de las microalgas desde el 2006, recolectando muestras y analizando con el microscopio de luz. Se destinaron a estudiar sólo las especies Navicula y Pinnularia por la abundancia en el estanque y sus efectos sobre éste. Le pregunté qué otras técnicas tienen para estudiar estas algas y su respuesta: dijo que encontraron en la literatura unos kit pero era preferible el microscopio de luz para comparación con las bases de datos.

El próximo afiche es de V. Román, estudiante de UPR-Humacao, su investigación es The Effect of Wastewater Influx in the Nutrient Composition and Abundance of Anoxygenic Photothrophs in Tropical Dairy Wastewater Lagoons. Este trabajo fue muy complejo, pero con buenos resultados. Su pregunta para empezarlo fue que pasa con las lagunas formadas de los desperdicios de vaquerías (excrementos, orín, etc.), que bacterias abundan, por que el olor característico y más. Ella encontró que bacterias anoxigénicas fototrópicas vivían en estos estanques, y que bajo condiciones anóxicas producían un pigmento. Con llevaron muchas técnicas para identificar los nutrientes que encontraron y para poder crecerlas en el laboratorio. Una de mis preguntas fue que si sabían de qué bacterias hablaban y su respuesta: se habían enviado a USA para caracterizar y que esperaban los resultados.

Por último, tenemos el afiche de la estudiante de UPR- Rio Piedras, con la investigación: Translational Control of Human Interleukin-3 Mediated by its 3’UTR Adenine Uridine-rich Sequences. Éste trabajo creo que es el más complicado de todos por que envuelve conceptos de genética, microbiologia, mucha paciencia y mucho PCR. En resumen, el resultado mostró que las mutaciones ocasionadas en hIL-3, específicamente, en ARE2 y ARE3, afectan eficiencia translacional de la luciferasa. Yo en realidad no entendí mucho pero si entendí que el propósito es para terapias contra el cáncer. Es algo muy bueno y me encantaría que pudiera encontrar todo para hacerlas. Sólo les deseos a todos el más grande éxito en sus vidas profesionales como personales y que sigan hacia adelante porque ya estamos haciendo historia.

Gracias a todos los que hicieron esto posible: AMGEN, personal de la Oficina de Programa Biotecnologia Industrial, la Profesora Carmen Amaralis Vega Olivencia, el Doctor Juan López Garriga (ambos de Dept. de Quimica), a Mario Ortega (estudiante doctoral de Quimica), al Programa AMP (PRLS-AMP Rio Piedras-Mayagüez), a mi familia (Mami, mi hermana, y mi novio) y a todos mis compañeros (Melody, Ivette, Montoyo, Juan C. y muchos más). Gracias!!!

Usando una escala de 1-5 indique el progreso que ha logrado con relación a las metas que estableció en su blog del 27 de enero.

· 1 – ningún progreso, no he logrado ningún de los objetivos propuestos.

· 2 – algo de progreso, he logrado al menos 10% de los objetivos propuestos.

· 3 – progreso intermedio, he logrado al menos 50% de los objetivos propuestos.

· 4 – mucho progreso, he logrado al menos 80% de los objetivos.

· 5 – excelente progreso, he logrado todos los objetivos para esta fecha.

Este mes ha sido uno fuerte, y con relación a mis metas no he podido lograr mucho.

¿Qué dificultades ha afrontado en relación a sus metas? ¿Qué ha hecho para atenderlas?

Ha sido la misma este semestre el sol-gel no ha querido pegarse al electrodo bien. He repetido ya el experimento más de cuatro veces. Para atender este problema hice una búsqueda en la literatura y voy a leer para ver si logro encontrar algún tip para poder facilitar la interacción solgel/HbI/electrodo. A pesar de este mal tiempo, este mes estaré presentando la investigación en el PRISM (este año en la Universidad de Rio Piedras), el sábado 14, de marzo de 2009. También, el sábado 21, de marzo de 2009 presentaré el Poster de la investigación en la Planta Piloto en Mayagüez. La primera auspiciada por PRLSAMP y la segunda por Bio MINDS.

Development of a Biosensor using HbI of Lucina Pectinata with

Purification Methods and Characterization by Electroanalytical Technique

Abstract

The hemoglobin HbI is produced by Lucina pectinata, a clam that uses it to transport H₂S. This protein is intended to be use as a biosensor to detect the presence of H₂S and, in order to do it, is important to study its electrochemical properties. The Cyclic Voltammetry technique is an electrochemical method used in analytical chemistry and various industrial processes, which was used to study the electrochemical properties in several biomaterials. Cyclic Voltammetry measures the faradic current while the potential is varied when oxidation and reduction processes occurred. This method was used to analyze the electron transfer kinetics of four different proteins: Cytochrome-c, Hemoglobin, Myoglobin and HbI using Glassy Carbon (GC) electrode as working electrode. Multi-Walled Carbon Nanotubes (MWCNT) were used to improve the signal obtained from the proteins in the cyclic voltammograms. The carbon nanotubes absorb the protein into their surface producing an interaction, which facilitates the electron transfer, giving better signals. Also, this work reports the purification methods for recombinated HbI and HbI/Sol-gel (TMOS) electrode, arranged by intermolecular interactions of the recombinant hemoglobin I from Lucina pectinata and TMOS (tetramethyl orthosilicate) in a carbon paste electrode. The spectra UV-Vis revealed that the protein is highly purified, showing recognized bands for two hemoglobin species. On the other hand, a pair of well-defined redox peaks for HbI[Fe(III)–Fe(II)] was obtained at the prepared electrode by direct electron transfer between the protein and sol-gel. Electrochemical parameters of immobilized hemoglobin such as formal potential (E°’), charge transfer coefficient (α) and apparent heterogeneous electron transfer rate constant (ks) were estimated by cyclic voltammetry and nonlinear regression analysis. The results suggested that the redox process was an adsorption-controlled and the immobilized hemoglobin was stable. Biocatalytic activity will be exemplified at the prepared electrode for redox process of hydrogen sulfide in future works and electron-transfer process in sol-gel still under investigation.

·         Propuesta de investigación para el semestre:

   o   Metas que planea alcanzar al final de este semestre:

         “Espero haber logrado …

               §   (1)…caracterizar electroquímicamente el electrodo modificado con sol-gel y HbI

               §   (2)…modificar electrodos de Glassy Carbon con diferentes hemoproteínas (myoglobin, hemoglobin,   citochrome c y Hb I) y Nafion.

               §   (3)…modificar electrodos de relleno con diferentes hemoproteínas (myoglobin, hemoglobin, citochrome c y Hb I), Nafion y Carbon paste.

               §  …trabajar con diferentes ideas que se nos ocurran tras el transcurso del semestre, revisando literatura hasta tener la mejor caracterización electroquímica.”

  o   ¿Cómo se basa el trabajo de este semestre en relación al anterior?

        Vamos a trabajar con lo mismo del anterior, se van ha mejorar procedimientos y trabajar con otras  hemoproteinas para comparar con Hb I. También, buscamos otras formas de encapsular proteínas sin dañar su conformación.

   o   ¿Qué nuevas técnicas planea desarrollar? Descríbalas.

        Básicamente, las técnicas son las mismas; tenemos que esperar encontrar alguna en la literatura que se pueda reproducir en el laboratorio. 

Nuestro proyecto de investigación durante este semestre se condujo con los siguientes objetivos: primero, en la obtención de una proteína recombinada por medio de cultivos bacterianos a gran escala, realizándose éstos en un biorreactor. Luego, se utilizarían técnicas de extracción y purificación de hemoproteínas para retener la proteína deseada y por último, la preparación de electrodos modificados con la proteína purificada para evaluar su comportamiento electroquímico utilizando la técnica de voltametría cíclica.

La preparación de los electrodos fue realizada con un electrodo de relleno completando el espacio con Hb I, Buffer fosfato pH = 6.5 y Sol-gels. El Sol-gel es el material que se utilizó para pegar la hemoproteína al electrodo. Para obtener resultados, lo que hemos hecho es caracterizar el electrodo modificado con la técnica de voltametría cíclica, es decir, que la hemoglobina responda bien y que esté estable en el electrodo, (que no se modifique con tantos cambios de potencial).

Primero, probamos si el cambio en potencial afectaba la hemoproteína, obtuvimos diferentes voltamogramas a diversas velocidades de barrido (desde 50 a 1000 mVs^-1). Verificando la data se realizó una gráfica del comportamiento lineal entre las intensidades de picos catódicos y anódicos con respecto a las velocidades de barrido. Se obtuvo una regresión lineal que demuestra que la hemoglobina está en buen estado y se mantiene estable en el sol-gel.

Otro aspecto que se investigó es el efecto del pH sobre las voltametrías. Se realizaron una serie de buffer de pH=4.5 hasta pH=9. Cada voltametrías fue hecha con un buffer distinto y se compararon dejándonos por el comportamiento en el pico catódico.  El rango de pH obtenido es desde 4.5 a 7, al cual es mejor trabajar con la proteína.

Como proyecciones futuras están la construcción y caracterización de tres electrodos: uno con Hb I sin purificar por FPLC, otro con Hb I más concentrada y todos los electrodos añadiendo Na₂S. También cambiar la estructura de la hemoglobina con diferentes aminoácidos y por último construir el sensor.

• Usando una escala de 1-5 indique el progreso que ha logrado con relación a las metas que estableció en su blog del 25 de agosto.

•       1 – ningún progreso, no he logrado ninguno de los objetivos propuestos.

•       2 – algo de progreso, he logrado al menos 10% de los objetivos propuestos.

•       3 – progreso intermedio, he logrado al menos 50% de los objetivos propuestos.

•       4 – mucho progreso, he logrado al menos 80% de los objetivos.

•       5 – excelente progreso, he logrado todos los objetivos para esta fecha.

Haciendo uso de esta escala he llegado a la máxima puntuación ya que hemos logrado completar los objetivos para este semestre de investigación. Hemos logrado obtener una proteína recombinada por medio de cultivos bacterianos a gran escala, realizándose éstos en un biorreactor, utilice diferentes técnicas de extracción y purificación para obtener hemoproteínas y por último, y lo más deseado, preparamos electrodos modificados con la proteína purificada para evaluar su comportamiento electroquímico.

• Resuma en base a los resultados de su investigación, la contribución científica de su proyecto.

Nuestra contribución científica será para mejorar los instrumentos que existen para medir la concentración de sulfuro de hidrógeno. Esto así ayuda en los campos de la salud, ambiente y más. De esto abundaré en una próxima entrada para en la que hablaré sobre esto y mis resultados.

• Seleccione una técnica que ha aprendido e indique cómo la va a usar en su laboratorio.

Técnicas de Purificación de Hemoproteínas

El objetivo principal es obtener una alta concentración HbI en las proteínas. Después de crecer en el biorreactor, el próximo paso es hacer el proceso de lisado (romper las membranas de las células para así poder extraer mejor la proteína), luego se usan las columnas de Talon para separar la proteína de lo que no queremos (en este proceso se usan unos buffers), después se someten a “desalting” y concentrar (quitarle la sal NaCl y concentrar). El último paso de purificación se conoce como exclusión por tamaño o FPLC, esto es una columna de cromatografía para separar a la proteína de lo que resta, y se vuelve a concentrar. Después del proceso de Talon y FPLC es bueno realizar espectroscopía de ultravioleta visible (UV) con la muestra de proteína para así conocer la concentración de HbI.

• Usando una escala de 1-5 indique el progreso que ha logrado con relación a las metas que estableció en su blog del 25 de agosto.

• 1 – ningún progreso, no he logrado ninguno de los objetivos propuestos.

• 2 – algo de progreso, he logrado al menos 10% de los objetivos propuestos.

• 3 – progreso intermedio, he logrado al menos 50% de los objetivos propuestos.

• 4 – mucho progreso, he logrado al menos 80% de los objetivos.

• 5 – excelente progreso, he logrado todos los objetivos para esta fecha.

Haciendo uso de esta escala, y evaluando mis adelantos en la investigación me otorgo un 4 indicando esto que he progresado mucho y sólo resta un 20% de mis objetivos (preparación de electrodos modificados con la proteína purificada para evaluar su comportamiento electroquímico). Me siento orgullosa de lo que he logrado, y debo darle las gracias a mi mentor el estudiante doctoral Mario Ortega Nuñez que colabora en los laboratorios de la Dra. Carmen A. Vega y del Dr. Juan López Garriga.

• ¿Qué dificultades ha afrontado en relación a sus metas? ¿Qué ha hecho para atenderlas?

Mi mayor dificultad es la organización del tiempo para mi investigación, mi trabajo, y mis clases. Mi falta está en determinar unas horas de trabajo y de investigación antes de saber cómo se iba a desarrollar mi vida en el transcurso de los días. He podido hacer unos arreglos con mi trabajo e investigación para que el tiempo no me falte. He bajado unas horas de trabajo para dedicarle más tiempo a la investigación.

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·            Propuesta de investigación para el semestre:

o   Metas que planeo alcanzar al final de este semestre:

“Espero haber logrado …

§  (1)…Obtención de una proteína recombinada por medio de cultivos bacterianos a gran escala, realizándose éstos en un biorreactor.

§  (2)…Técnicas de extracción y purificación de hemoproteínas.

§  (3)…Preparación de electrodos modificados con la proteína purificada para evaluar su comportamiento electroquímico.

·         ¿Cómo se basa el trabajo de este semestre en relación al anterior?

Mi investigación del semestre anterior tenía como objetivo conocer la técnica de voltametría cíclica, la preparación de muestras y utilización de electrodos con diferentes superficies. El trabajo de este semestre se basa en dos tópicos: el aprendizaje de las ténicas de obtención de proteínas y en la aplicación se intentará preparar electrodos modificados con la proteína en diversas superficies con la finalidad de evaluar su potencial de reducción.

La utilidad de medir el potencial electroquímico es porque esta medida nos provee información estructural de la proteína, es decir, nos dice sobre la influencia que tienen algunos residuos de aminoácidos que rodean a la porfirina que contienen este tipo de proteínas. A la vez esto te aporta valiosa información de la reactividad de la proteína, es decir, te da idea de porque algunas hemoproteínas son mas selectivas a reaccionar y/o atrapar ciertos gases. (O₂, NO, CO, H₂S…)

·           ¿ Qué nuevas técnicas plantea desarrollar?

Técnicas de extracción y purificación de hemoproteínas: lizado, centrifugar, cromatografía por exclusión molecular, entre otras.

Este semestre en la investigación he aprendido que todo lo que una persona pueda proponerse y se esfuerce puede alcanzar su meta. Pero todo esto conlleva barreras y retos, en mi caso mi mayor barrera fue el manejo de tiempo, ya que no sabía organizarme. Al final entendí el concepto y pude realizar mejor mi trabajo. Para todo esto es bien inportante ser organizado y manejar el tiempo desde el principio.

Mis expectativas para el próximo semestre son realizar un mejor trabajo en mi investigación ya que tengo más conocimiento del equipo que se utiliza, un mejor manejo de tiempo entre clases, investigación y vida social.

Esto fue una grata experiencia, y estoy muy orgullosa del trabajo y esfuerzo aplicado aquí. Les doy las gracias a mis compañeros de investigación y sobre todo a mi mentora la Profesora Carmen Vega, Ph.D.

Gracias a todos y éxito durante el próximo semestre.

En la visita a los blogs de mis compañeros encontré una diversidad de recintos y temas: dos relacionados al campo de la salud y otro con los animales para la realización de un censo. El trabajo de Jetsy Caraballo, del Colegio es uno muy interesante ya que envuelve el aprender técnicas de laboratorio como centrifugar e infrarojo. Creo también que tiene una perspectiva hacia el campo de la salud por que habla sobre diferentes tipos de cáncer. Espero que le vaya bien y no deje que los obstáculos la detengan. El trabajo de Jessica Torres del Recinto de Cayey me gusto mucho por que trata con la diabetes tipo II y es algo que afecta a muchas persona y envuelve el campo de la salud. Tambien es interesante que otras técnicas utilizara para la averiguar el efecto de medicina natural contra la diabetes tipo II. El trabajo que realizará Rebeca Hernández, del Recinto de Humacao es una muy fuerte pero lleno de experiencias ya que tendrá la oportunidad de realizar un censo de las aves en algún lugar no especificado. Aunque los animales no son mi fuerte, creo que es interesante su trabajo ya que su compañera y ella comienzan desde cero realizando una propuesta y todo. la acción que estas dos jovenes toman tambien es importante ya que los que encuentren aquí es para la ayuda de un profesor que realizará un atlas de las aves en PR.  Les deseo mucho éxito durante los tres semestres y que encuentren cosas para la mejoría de la salud y para el conocimiento de las aves, respectivamente.

Ahora pasando a otro tema, ya conocen que mi investigación la técnica de voltametría cíclica es lo fundamental, trabajando con los electrodos y más. Con ésta lo que se hace es recoger señales las cuales muestran o en las cuales identificamos analitos que se estudian dependiendo de sus picos que se miden con la corriente que ejercen. Básicamente es una técnica de análisis cuantitativo muy comúnmente utilizada, ésta permite caracterizar el sistema electroquímico. Muchas voltametrías cíclicas permiten hallar número de electrones transferidos en una reacción redox, potenciales formales, constantes de velocidad, coeficientes de difusión y mecanismos de reacción.

Durante este período transcurrido se observó que realizar los estudios en la superficie de glossy carbon era mejor ya que la regiones ha estudiar (de Cu 2+ y Fe 3+) se apreciaban más con éste. Al contrario de las superficies de oro y platino que restringían el espacio a estudiar. Conociendo esto dimos el segundo paso, irradiar con luz ultravioleta las soluciones por un período  de tiempo determinado. Notamos unos cambios en los picos de Cu y Fe los cuáles nos sorprendieron.

También realizamos corridas a diferentes sensitividades para ver como se comportaban el Cu y Fe. Con esta información se calculará más adelante los electrones transferridos conociendo el número de segmentos, ya que las corridas consisten de un ciclo que contiene dos segmentos uno de oxidación y uno de reducción. Hasta aquí es lo que hemos estado haciendo en la investigación ya que toma tiempo la realización de las corridas y discutir lo que se ve en éstas.

La experiencia hasta ahora a sido magnífica, trabajar en equipo no me ha quitado las ganas de continuar, en cambio todos nos ayudamos, compartimos tareas y también las rotamos para que cada uno pase por la experiencia. La Profesora Carmen Vega ha sido maravillosa tanto como profesora como persona, en fin al tener tanto conocimiento del tema me asombra. Le doy gracias a las personas que han hecho todo esto posible ya que esto es una oportunidad que no todos saben apreciar y que para mi me ayuda ha enriquecerme como persona y como profesional.